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搭載多波長激發(fā)光源，調(diào)制模式具備完整的PAM功能，可測量PSⅡ功能性捕光截面Sigma(Ⅱ)

非調(diào)制泵浦探針技術(shù)，可監(jiān)測OEC狀態(tài)與衰減，周期-4-震蕩，類胡蘿卜素三重態(tài)能量弛豫

近日，德國WALZ公司在其網(wǎng)站正式上線其潛心研發(fā)的新款多功能調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMULTI-COLOR-PAM-Ⅱ。新款MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是一款緊湊型儀器，同時(shí)包含兩種截然不同的技術(shù)：單翻轉(zhuǎn)閃光動力學(xué)(STK)和PAM技術(shù)。

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MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的亮點(diǎn)

? 一臺儀器兩種功能：非調(diào)制超快閃光動力學(xué)分析和多激發(fā)波長調(diào)制(PAM)應(yīng)用；

? 超快時(shí)間分辨率：一套完整的快速測量組合(時(shí)間分辨率低至0.3μs)，可以探測PSⅡ供體側(cè)放氧復(fù)合體Period-4震蕩和類胡蘿卜素三重態(tài)(Car-trip)的生成與能量弛豫；

? 多激發(fā)波長調(diào)制(PAM) 測量應(yīng)用，可以探測PSⅡ受體側(cè)、電子傳遞鏈和光合作用光化學(xué)活性；

? 兩種技術(shù)組合使用：例如使用3 μs飽和閃光，通過PAM測量光監(jiān)測誘導(dǎo)熒光信號的衰減動力學(xué)。測量光頻率按對數(shù)遞減。

MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的新功能

? 高時(shí)間分辨率：新的STK探測器提供0.3 μs的時(shí)間分辨率；

? 時(shí)間分辨閃光響應(yīng)：MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ可以測量飽和 μs 閃光期間的熒光產(chǎn)量，并可以區(qū)分類胡蘿卜素三重態(tài)淬滅(TQ)和供體側(cè)依賴性淬滅(DQ)；

? 高精度：為了詳細(xì)分析閃光響應(yīng)，它們的時(shí)間非常精確且可重現(xiàn)，閃光的形狀接近矩形，LED需要大約0.5μs才能達(dá)到完全強(qiáng)度。為閃光配置文件校正提供了一個(gè)特殊的例程；

? 極強(qiáng)的閃光：使用EDST發(fā)射器檢測器單元可以實(shí)現(xiàn)超過1000000 μmol 440 nm m^-2 s^-1的閃光強(qiáng)度(每μs產(chǎn)生超過1個(gè)激發(fā))；

? 泵浦探針：具有可變暗間隔 ?t(從1μs到10ms)的雙閃實(shí)驗(yàn)，允許對各種形式的淬滅進(jìn)行高度靈活的弛豫測量；

? 周期4振蕩：高達(dá)100Hz(10ms間隔)的閃光頻率可用于閃光序列，以探測放氧復(fù)合物的S狀態(tài)；

? 葉片測量：雖然該儀器最初是為懸浮液測量而設(shè)計(jì)的，但EDST發(fā)射器檢測器(STK-flashlamp)裝置也可以單獨(dú)用于測量植物葉片。此外，即將推出一種配置，其中兩個(gè)發(fā)射器相對于多波長發(fā)射器呈45° 角放置，這允許對葉片發(fā)出的熒光進(jìn)行兩種波長的檢測；

? PAM記錄中嵌入的STK：由于在快速非調(diào)制和PAM測量之間快速切換[8-10μs切換時(shí)間]，ST可以放置在傳統(tǒng)測量中的任何位置，例如O-I₁-I₂-P或慢速動力學(xué)記錄，所得STK揭示了閃光時(shí)刻PS Ⅱ狀態(tài)的詳細(xì)信息。所有這些結(jié)合在一起，使MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ成為一款非常全面的熒光計(jì)，允許用戶以多種不同的方式探測和監(jiān)測PS Ⅱ和光合電子傳遞鏈。

Multi-Color-PAM-Ⅱ的重要升級

? 在多激發(fā)波長(PAM)配置中，用戶可以測量與激發(fā)波長相關(guān)的有效PSⅡ天線尺寸信息：Sigma(Ⅱ)、PS Ⅱ受體側(cè)的反應(yīng)(QA-再氧化)和沿電子傳遞鏈的電子流(O-I₁-I₂-P/OJIP瞬變)，還可以進(jìn)行飽和脈沖淬滅分析、誘導(dǎo)曲線和暗弛豫曲線，以及光響應(yīng)曲線，所有這些都適用于5種不同的激發(fā)和測量光波長(440、480、540、590、625 nm)以及可以任意組合應(yīng)用的白光。這樣做的好處是，例如，使用硅藻作為研究對象的人可以在綠色中激發(fā)這些生物，在藍(lán)藻的情況下，可以選擇625 nm來激發(fā)藻膽體或440 nm來激發(fā)核心天線的葉綠素；

? MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的高靈敏度允許使對薄的樣品進(jìn)行測量，即在沒有光質(zhì)和光強(qiáng)梯度的情況下測量樣品，在很大程度上避免了波長依賴性的熒光重吸收；

? 使用濾光片自由選擇檢測波長，例如，能夠檢測熒光λ>700 nm，富含PSI熒光F(I)和λ< 710 nm，富含PSⅡ熒光F(Ⅱ)，可以在相同條件下同時(shí)測量；

? 通過比較PAM和閃光動力學(xué)(STK)測量來表征給定樣品的相同狀態(tài)；

? 創(chuàng)建Trigger和Script文件可以進(jìn)行自定義實(shí)驗(yàn)程序測量，充分發(fā)揮用戶自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)造力。

Multi-Color-PAM-Ⅱ的應(yīng)用實(shí)例

來自三個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域的示例實(shí)驗(yàn)

MULTI-COLOR-PAM-II的應(yīng)用程序分為3個(gè)部分：

1. 光合活性相關(guān)的應(yīng)用，如誘導(dǎo)曲線，誘導(dǎo)+暗弛豫曲線和光曲線自動程序，或手動測量。

2. 基于腳本的應(yīng)用，如O-I₁-I₂-P/OJIP瞬變、單周轉(zhuǎn)閃光后QA-的再氧化動力學(xué)、Sigma(II)測定。

3. 基于ST閃光的實(shí)驗(yàn)，如周期4振蕩、類胡蘿卜素三重態(tài)誘導(dǎo)和衰減動力學(xué)，P680⁺。

前兩部分代表PAM應(yīng)用，最后一部分代表單周轉(zhuǎn)動力學(xué)(STK)應(yīng)用。

光曲線/淬滅分析

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上圖是測量PS II互補(bǔ)量子產(chǎn)率Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1的光曲線示例。由于記憶效應(yīng)，光強(qiáng)減弱時(shí)誘導(dǎo)的動力學(xué)可能與光強(qiáng)增強(qiáng)時(shí)不同。這種現(xiàn)象被稱為滯后。這里觀察到的光誘導(dǎo)Y(II)降低和Y(NPQ)升高的完全可逆性是生理健康樣品的特征。

測量快速動力學(xué)(PAM)

通過兩個(gè)不同波長測量的O-I₁-I₂-P瞬變

PAM快相應(yīng)用的一個(gè)例子是同時(shí)測量兩個(gè)不同波長的O-I₁-I₂-P瞬變：在波長<710 nm處測得的熒光主要是PSⅡ熒光，而>700 n處的熒光則是PSⅡ和PSI熒光的混合熒光。該結(jié)果是由Klughammer等人(2024年)對小球藻細(xì)胞稀釋懸浮液(440nm ML和MT)的測量首次發(fā)現(xiàn)的。

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兩種波長的O-I₁上升(曲線歸一化為I₁)相同。I₂和P之間存在差異：與F<710nm相比，在 F>700nm時(shí)，I₂-P上升更明顯。

下圖是使用雙波長葉片配置，通過440 nm測量光和光化光測量大麥葉片的結(jié)果。

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這兩項(xiàng)測量結(jié)果再次歸一化為I₁(所有QA均已還原)。同樣，與F<710nm相比，F(xiàn)>700nm處的I₂-P上升更為明顯。O-I₁的上升動力學(xué)稍慢，這反映出 F<710nm波長處的自吸收比F>700nm波長處高，因此F>700nm波長處來自葉片相對較深的層，那里的有效輻射光強(qiáng)度較低。

功能性捕光截面Sigma(Ⅱ) 測量

參數(shù)Sigma(II)反映了PSⅡ捕光天線的有效截面。Sigma(Ⅱ)的測定（及其波長依賴性）是另一種PAM快速動力學(xué)測量的應(yīng)用。有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可以用來判斷用于 Sigma(Ⅱ)測定的O-I₁擬合是否良好：1. 擬合應(yīng)能很好地描述熒光的上升；2. 得到的擬合參數(shù)應(yīng)與生理相關(guān)；3. 獲得的Sigma(Ⅱ)值應(yīng)與光照強(qiáng)度無關(guān)。在這里，觀察到Sigma(Ⅱ)值隨著所用培養(yǎng)物的階段而增加。

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在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，連通性參數(shù)J被固定為1.2，這是Anne和Pierre Joliot在1964年獲得的值。該數(shù)據(jù)集顯示了近乎完美的擬合、合理的參數(shù)值，本質(zhì)上是高光強(qiáng)度下光強(qiáng)度的獨(dú)立性，產(chǎn)生了定義明確的O-I₁動力學(xué)。

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單周轉(zhuǎn)閃動力學(xué)STK應(yīng)用

? 類胡蘿卜素三重態(tài)衰減

下圖顯示了一組測量值，根據(jù)這些測量值可以確定類胡蘿卜素三重態(tài)衰變動力學(xué)。該數(shù)據(jù)集說明了閃光時(shí)間的精度，以及閃光燈提供兩次相隔1μs的相同強(qiáng)度閃光的能力。

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? 閃光長度和熒光誘導(dǎo)

另一個(gè)案例是雙閃實(shí)驗(yàn)，其中第一次閃光的長度是變化的，第二次閃光是在第一次閃光40微秒后進(jìn)行的。

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閃光序列和閃光模式可以告訴我們一些有關(guān)S態(tài)的信息，即供體側(cè)錳簇的氧化還原態(tài)。它們還能告訴我們不同強(qiáng)度的遠(yuǎn)紅外光的影響。

? 周期-4 振蕩

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軟件可自動得出 Fo、Fm 或 Fv水平的周期-4 振蕩(圖摘自Klughammer等人，2024年)。

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在咖啡葉片中，F(xiàn)R1照明已導(dǎo)致可變熒光中的周期-4 振蕩受到強(qiáng)烈抑制。在這種情況下，MULTI-COLOR-PAM-II可以將有效的FR強(qiáng)度進(jìn)一步降低到FR1的10%，這就大大降低了對咖啡葉S態(tài)的影響。

STK和PAM組合測量

下一個(gè)案例展示了如何通過STK和PAM測量光的組合，將精確、高強(qiáng)度和短時(shí)間的STK和PAM測量光結(jié)合起來，以監(jiān)測黑暗中的熒光衰減。

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在PAM測量中，對受DCMU抑制(藍(lán)色)或未受抑制(紅色)的稀釋小球藻樣本施加3 μs STK閃光。從閃光后100 μs開始，ML頻率從100 kHz對數(shù)下降到10 kHz（圖摘自Klughammer等人，2024年）。

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